La méthodologie retenue consiste à analyser 4 tronçons ferroviaires d'une vingtaine de km de long chacun : 2 sur LGV totalement clôturées en Bourgogne et en Lorraine et 2 sur voies ferrées classiques non clôturées en Franche-Comté et en Rhône-Alpes. Les sites retenus sont donc tous situés dans l'Est de la France et ont été choisis pour traverser une proportion importante de milieux forestiers et de milieux agricoles en mosaïque.

Pour chaque site, il s'agit d'évaluer la transparence des infrastructures pour 5/6 groupes taxonomiques complémentaires présentant des modalités de dispersion différentes : les "grands" mammifères terrestres, les petits mammifères terrestres (abandonné pour raison d'épidémie de fièvre hémorragique chez le campagnol roussâtre), les chiroptères, les amphibiens et 2 groupes d'insectes. Pour ce faire un échantillonnage a été engagé afin d'évaluer les traversées en section ferroviaire courante (c'est-à-dire au-dessus des rails, hors ouvrages de franchissement) et dans différentes catégories d'ouvrages (passages supérieurs et inférieurs : passages faune, rétablissements de chemins agricoles et petites routes, ouvrages hydrauliques...) pour les différents groupes taxonomiques mentionnés..

Les méthodes mises en oeuvre par Ecosphère ont fait appel à différentes techniques classiques de capture ou de relevés d'indices : utilisation de pièges photographiques (grands mammifères) et utilisation d'enregistreurs d'ultrasons pour les chiroptères..

Le MNHN (Service du patrimoine naturel) et le CNRS de Moulis ont collaboré pour évaluer la transparence des tronçons en utilisant les techniques de génétique du paysage via l'outil moléculaire. En prélevant de l'ADN sur des individus de plusieurs populations situées de part et d'autre des lignes ferroviaires, les analyses ont permis de mesurer le degré de coupure des voies. Trois espèces ont été étudiées : un amphibien (Salamandre), un papillon (Myrtil) et un Carabe (Féronie noire).